...选用的pGL3-basic，请问是选取pre-
编辑： admin 2017-12-03
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pGL3-basic是检测启动子的荧光报告载体,当然是将miR的启动子序列构建上去.
内切酶按照你基因和多克隆位点的序列来选择.
类似问题
类似问题1：绿色荧光蛋白和荧光素酶基因是基因工程中广泛使用的两个报告基因,哪个基因表达蛋白的检测更灵敏?[生物科目]
绿色荧光蛋白GFP自身发光,不需底物.荧光素酶Luciferase需要荧光素底物
当实验中可以加入足够的荧光素底物的时候,因为酶的放大效应,荧光素酶更灵敏.
类似问题2：荧光素酶报告基因与GFP区别?能定量检测表达蛋白的报告基因有哪些?[生物科目]
只能先就标题的问题谈谈我的认识.后面的追问我了解得也不全面.
1.两者的结果检测方法不同.GFP绿色荧光蛋白,很直观,能够直接检到荧光,在普通的细胞培养条件下都能够观察到,对细胞的生命活动和其他并行的实验安排影响很小.荧光素酶报告基因使用起来比GFP多一个步骤,因为荧光素酶是个酶,不发荧光,发荧光的是它的底物,荧光素.荧光素在细胞里（要说萤火虫细胞我就不知道了哦）是没有的.所以检测荧光素酶的通常步骤是裂解细胞,释放荧光素酶,与荧光素及其他所需化学物质混合,才得到荧光.现在虽然也有活细胞内检测荧光素酶的手段,但要将荧光素送入活细胞,本身就已要对细胞进行相当的干扰.所以一般来说荧光素酶实验的同一批细胞不适合再做其他并行实验.
2.两者的结果含义不同.GFP如果说是定量检测表达蛋白的话,这个定量只能够指,表达的细胞是多少个,不表达的细胞是多少个.GFP对于单个细胞来说,就有阳性和阴性两种结果罢了.GFP不能够定量地告诉你,这个/群细胞里的表达量是多高还是多低.荧光素酶就能够定量地得到表达量/表达水平的数值,但这个数值是相对于一群细胞来说,而不是对于单个细胞.所以荧光素酶常常用来研究启动子的功能与调控,因为启动子对基因表达的调控可以是渐变的,而不是简单的开和关两种状态.
类似问题3：siRNA转染肝癌HEPG2细胞,沉默miRNA是什么意思?是为了沉默miRNA的靶基因吗?需要构建质粒载体吗?查资料都是说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA.其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因
我觉得你是弄错东西了吧 siRNA和miRNA是类似的 都是用来沉默靶基因的表达 不同的是miRNA是一个调控多个 而siRNA是一个只调控一个 你可能遇到的实验是先验证miRNA通过调控几个基因达到某种效果 然后单独转这几个基因的siRNA 看是否有这种效果 以确定该miRNA确实是通过这几个基因达到这种效果 可能说的比较绕了 不懂的再问我吧
类似问题4：鲫鱼的荧光素酶的大小?还有鲫鱼荧光素酶融合载体的构建步骤.[生物科目]
先说明一点,鲫鱼本身没有荧光素酶,有荧光素酶的鲫鱼是转基因鲫鱼,
载体构建步骤：
1.提取荧光素酶基因（利用cDNA文库里的）
2.寻找质粒（一般用大肠杆菌的）
3.用特定的限制酶切割目的基因,质粒
4.加入DNA连接酶,使二者连接起来
5.对重组质粒进行检测,合适的（连上了荧光素酶基因的）可以使用
荧光素酶资料：是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称,其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrali'的萤火虫体内的荧光素酶.在相应化学反应中,荧光的产生是来自于萤光素的氧化,有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）.没有荧光素酶的情况下,萤光素与氧气反应的速率非常慢,而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）.
荧光生成反应：
通常分为以下两步：
1:萤光素 + ATP → 萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate） + PPi
2:萤光素化腺苷酸 + O2 → 氧荧光素 + AMP + 光
这一反应非常节省能量,几乎所有输入反应的能量都被转化为光.与之形成鲜明对比的是人类使用的白炽灯,只有越10%的能量被转化为光,剩余的能量都变为热能而被浪费.
荧光素酶分析：
荧光素或荧光素酶不是特定的分子,而是对于所有能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称,虽然它们各不相同.不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应.最为人所知的发光生物是萤火虫,而其所采用不同的荧光素酶与其他发光生物如荧光菇（发光类脐菇,Omphalotus oleariu'）或许多海洋生物都不相同.在萤火虫中,发光反应所需的氧气是从被称为腹部气管（abdominal trachea）的管道中输入.一些生物,如叩头虫,含有多种不同的荧光素酶,能够催化同一荧光素底物,而发出不同颜色的荧光.萤火虫有2000多种,而叩甲总科（包括萤火虫、叩头虫和相关昆虫）则有更多,因此它们的荧光素酶对于分子系统学研究很有用.目前研究得最透彻的荧光素酶是来自Photinini族萤火虫中的北美萤火虫
荧光素酶
荧光素酶可以在实验室中用基因工程的方法生成,并被用于多种不同的实验.荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中.研究者利用基因工程已经使得小鼠、家蚕、马铃薯等一些生物可以合成荧光素酶.间接体外成像是一种强大的研究手段,可以对整个动物体中的细胞群落进行分析：将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶,就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身.
在荧光素酶中加入正确的荧光素底物就可以放出荧光,而发出的光子可以被光敏感元件,如荧光探测器或改进后的光学显微镜探测到.这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能.例如,荧光素酶可以被用于检测血库中所存血液中的红血球是否开始破裂.法医可以用含有荧光素酶的溶液来检测犯罪现场中残留的血迹.医院用荧光素酶的发光来发现特定的疾病.荧光素酶还可以作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中,例如,用于在转染过荧光素酶的细胞中检测特定启动子的转录情况或用于探测细胞内的ATP的水平；这一技术被称为报告基因检测法或荧光素酶检测法（Luciferase Assay）.荧光素酶是一个热敏感蛋白,因此经常被用于研究蛋白热变性过程中热休克蛋白的保护能力.
类似问题5：为什么荧光分光光度计不能检测荧光素酶报告基因发出的荧光
1.滤光片是否选用得当?
2.灵敏度是否调节合适?